C’est quoi un profil génétique?

Établir le profil génétique d’une tumeur revient à regarder l’ADN des cellules qui la composent à la loupe afin de répertorier et d’interpréter les anomalies moléculaires (mutations).

Connaître les mutations présentes dans l’ADN des cellules cancéreuses permet d’identifier les protéines altérées et peut aider à:

poser un diagnostic, en repérant les protéines altérées responsables de la progression de la tumeur;

choisir le meilleur traitement, en repérant les protéines altérées qui  pourraient être la cible d’un médicament et/ou en repérant  les protéines altérées qui pourraient induire une résistance à un médicament.

SÉQUENCER l’ADN

Pour établir le profil génétique d’une tumeur, il faut séquencer l’ADN des cellules qui la composent.

L’ADN est constitué de 2 brins complémentaires: chaque brin est une succession de quatre molécules (nucléotides), symbolisées par les lettres a, c, g et t. Le nucléotide a et toujours en face du nucléotide t et le nucléotide c en face du nucléotide g.

Séquencer l’ADN revient à déterminer l’ordre dans lequel se succèdent ces 4 nucléotides dans un des 2 brins de l’ADN.

Une technique de séquençage de l’ADN a littéralement révolutionné les sciences de la vie: le séquençage nouvelle génération à haut débit, ou NGS (Next Generation Sequencing).

Le NGS est une technique qui permet de séquencer de très grandes quantités d’ADN en un temps record.

Plus de 10 milliards de fragments d’ADN d’une longueur de 150 à 300 nucléotides peuvent être séquencés en quelques heures!

Une biopsie de la tumeur est effectuée.

L’ADN est extrait des cellules de la biopsie.

L’ADN est fragmenté.

Chaque fragment d’ADN (double brin) est séparé en deux fragments simple brin.

Des millions de fragments d’ADN (simple brin) sont obtenus.

Les fragments ADN (simple brin) sont fixés sur un support. Chaque fragment est copié plusieurs centaines de fois.

La synthèse du brin complémentaire se fait en présence des 4 nucléotides a, c, g, t, associé chacun avec un fluorophore qui émet de la lumière de couleur différente. Un seul nucléotide est inséré à la fois grâce à la protéine ADN polymérase. Un nucléotide a est toujours inséré en face d’un nucléotide t et un nucléotide c est toujours inséré en face d’un nucléotide g.

Cycle 1: l’incorporation d’un  nucléotide émet un signal lumineux coloré.

Cycle 2: l’incorporation d’un second nucléotide émet un signal lumineux coloré.

Cycle 3: l’incorporation d’un troisième nucléotide émet un signal lumineux coloré, etc.

Voici l’illustration d’une image prise lors d’un cycle sur un support avec 100 fragments d’ADN.

Voici une partie d’une image réelle prise lors d’un cycle sur un support de 10 cm2 qui contient environ 10 milliards de fragments d’ADN.

L’analyse de l’enchaînement de ces images permet de décrypter les séquences d’ADN de plusieurs milliards de fragments d’ADN d’une longueur de 150 à 300 nucléotides en quelques heures!

Pas encore utilisées en clinique, de récentes techniques de séquençage permettent désormais de séquencer de très longs fragments d’ADN (vidéo).

De telles comparaisons permettent de «voir» quels nucléotides dans l’ADN des cellules cancéreuses diffèrent de ceux du génome de référence.

Pour qu’une différence soit validée comme «mutation», il faut qu’elle soit présente dans un nombre minimum de fragments.

Au final plusieurs centaines de mutations peuvent être validées.

Dans l’exemple montré, une mutation t -> a est présente (*).

Le nucléotide a est retrouvé dans plusieurs fragments et remplace le nucléotide t présent dans la séquence ADN du génome humain de référence (en gris).

Analyser l’ensemble de l’ADN des cellules cancéreuses est un processus très long et complexe.

Trouver quelques dizaines de «fautes d’orthographe» dans un texte de 6 milliards de lettres est un véritable défi, surtout si ce texte est présent en millions d’exemplaires, puisqu’il existe des millions de cellules au sein d’une biopsie d’une tumeur.

Il existe aujourd’hui des techniques qui permettent de sélectionner l’ADN que l’on veut analyser.

Les chercheurs peuvent alors séquencer spécifiquement :

→ un ensemble de 50 à 500 gènes (panel de gènes) que l’on sait être fréquemment modifiés dans les tumeurs, ce qui représente moins de 0.025 % du génome humain (entre 500’000 et quelques millions de nucléotides).

→ les parties de l’ADN contenant l’information qui code pour des protéines, soit l’ensemble de la partie codante des gènes, appelées exons (exome), ce qui représente moins de 2 % du génome.

INTERPRÉTER LES MUTATIONS

Le séquençage et l’analyse bioinformatique d’un panel de 50 gènes génère, en moyenne, une liste de quelques dizaines voire centaines de mutations intéressantes.

Certaines mutations ne jouent aucun rôle dans le développement d’un cancer ou sur le choix du traitement. Certaines, par exemple, ne modifient pas la séquence d’une protéine, et donc sa fonction. D’autres mutations modifient la séquence de la protéine mais n’ont pas d’impact sur sa structure 3D et sa fonction.

Comment, alors, décider qu’une mutation est biologiquement plus importante qu’une autre ?

C’est le début d’une grande enquête!

L’IMPORTANCE DES BANQUES DE DONNÉES

Si elles sont connues, les informations relatives à une mutation et à son éventuel effet sur la fonction d’une protéine ou sur la réponse à un médicament sont répertoriées dans différentes banques de données spécialisées. Chaque information est susceptible d’être complétée ou corrigée au cours du temps, en fonction des avancées scientifiques et techniques (‘disclaimer’).

LORSQUE RIEN N’EST CONNU…

Dans environ 25 % des cas, l’effet d’une mutation sur la fonction d’une protéine n’est pas connu. On fait alors appel à des outils de prédiction bioinformatiques et en particulier à la modélisation moléculaire.

Il arrive cependant qu’aucune information ne puisse être retrouvée sur l’effet de certaines mutations. Ces mutations sont appelées « variants of unknown clinical significance » (VUS; variants sans signification clinique connue).

Exemple de rapport adressé à l’oncologue

« La mutation BRAF V600E a été retrouvée dans les cellules de la tumeur du patient.

Cette mutation est référencée comme « pathogène » (ou « driver ») dans plusieurs banques de données internationales et par de nombreuses publications scientifiques. La répercussion fonctionnelle de cette mutation est bien établie : elle est responsable de la progression de la tumeur.

Cette mutation est somatique et ne peut pas être utilisée dans le cadre d’un dépistage informatif pour les autres membres de la famille.

Il existe un médicament qui cible spécifiquement BRAF V600E – le vemurafenib. »